抗菌素/抗菌防腐剂/Zeocin

规格	包装	价格	货期	提交
BR	100毫克	630	现货
BR	1克	5000	现货

产品描述

Zeocin是博来霉素/腐草霉素抗生素家族的一个成员，是从Streptomyces verticillus中分离的水溶性、铜离子螯合糖蛋白抗生素，铜离子存在使得溶液呈蓝色。这种铜离子螯合形式是没有活性的，当抗生素进入细胞后，Cu²⁺被还原成Cu⁺，并被细胞中的巯基化合物除去。此时，Zeocin才被活化并与DNA结合，对DNA进行切割，从而引起细胞死亡。而Zeocin耐受基因（Sh ble）编码的蛋白质可以与Zeocin结合，并抑制Zeocin切割DNA。Zeocin作用谱非常广，其对细菌，真菌（包括酵母菌）、植物和哺乳动物细胞都有很强的抗菌活性，因此Zeocin常用作一种非常有效的工具抗生素，用来筛选携带Sh ble抗性基因并能稳定表达分子量为13.665kDa的一种Zeocin抗性蛋白的细胞株。

本产品为溶于高纯度水的无菌溶液形式，浓度为100mg/ml，细胞培养级。

产品性质

CAS号（CAS NO.）	11006-33-0
分子式（Formula）	C₅₅H₈₅O₂₁N₂₀S₂Cu - HCl
分子量（Molecular weight）	1535
纯度（Purity）	>90% by HPLC
结构式（Structure）

运输与保存方法

冰袋运输。产品-20°C避光保存。避免反复冻存，有效期1年。

应用浓度

1) 大肠杆菌（E. coli）：25-50 µg/ml，用低盐LB培养基筛选（NaCl浓度不能超过5g/L)；

2) 酵母菌：50-300 µg/ml，用YPD或基本培养基（minimal medium）筛选；

3) 哺乳动物细胞：50-1000 µg/ml，根据细胞选择合适的培养基。

操作步骤（哺乳动物细胞筛选）

【注1】Zeocin用于筛选哺乳动物稳定转染细胞的浓度范围为50-1000µg/ml，平均工作浓度范围为250-400µg/ml。影响筛选浓度的主要因素包括离子强度，细胞类型，细胞密度以及生长速率。以下步骤仅作参考，请根据自身实验体系做适当调整。

【注2】Zeocin的杀灭机制不同于新生霉素（neomycin）和潮霉素（hygromycin），细胞不会聚集成团或从培养板表面脱落。一旦接触到Zeocin，敏感细胞会出现如下的形态变化：1）细胞体积明显增加（类似于巨细胞病毒感染容纳性细胞引起的肿大效应）；2）异常的细胞形状包括细胞长臂（long appendages）出现；3）胞浆内出现大型空泡（源于内质网、高尔基体或支撑蛋白的破裂）；4）质膜和核膜破裂，导致膜上出现许多孔。这些敏感细胞最终会完全破损，仅以细胞碎片的形式存在。

【注3】Zeocin抗性细胞继续正常生长，长成不同于敏感细胞的克隆。形态上，其与未接触Zeocin的正常细胞没有差异。

一、建立杀灭曲线

1) 重新铺板或者将满盘细胞重新分盘，使得细胞密度约25%，按照8个平板/组准备，培养24h。

2) 去除旧培养基。加入含不同浓度Zeocin的筛选用培养基，Zeocin浓度可设置为0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每个浓度做3个平行；也可根据自身实验体系，设置不同的浓度梯度。

3) 每3-4天更换新鲜的筛选培养基，并观察存活细胞的比例。选择在合适的时间（1-2周内）杀死大多数细胞的浓度为最佳工作浓度。【注】：若是难以在显微观察下区分活细胞，也可用台盼蓝染色来计算存活细胞的数量，以确定Zeocin的最适浓度。

二、筛选稳定转染细胞

1) 转染细胞，用100mm培养皿进行培养。以未转染的细胞作为阴性对照。

2) 转染后，用预热的1X PBS洗涤一次，加入新鲜培养基。

3) 转染48-72h后，用含有最佳浓度Zeocin（由灭杀曲线确定）的新鲜培养基筛选细胞。为了更好的鉴定和筛选细胞集落，建议将细胞按比例稀释成一系列浓度。

【注】：若待筛选细胞对Zeocin的抗性明显强于大部分细胞，或者细胞快速分裂导致低浓度情况Zeocin的筛选效果不明显，按照以下方法克服此类耐性：a）将细胞直接用含Zeocin的筛选培养基进行分盘；b）37°C孵育2-3h直至细胞贴壁；c）从培养箱内取出细胞并于4°C放置2h，一定要确保培养基内含有HEPES。【此步的目的在于短时间内终止细胞分裂活动，从而允许Zeocin抗性得以发挥，杀死细胞。】c）细胞重新放回37°C培养箱内培养。

4) 每3-4天加入选择培养基，直到出现细胞集落。

5) 挑选并转移克隆到96或48孔板中。在进行更大孔径培养板或培养皿上扩大培养之前，确保培养细胞密度近100%。

三、维持培养稳定转染细胞

可采取以下方式维持培养稳定转染细胞，1）使用含相同剂量Zeocin的筛选培养基来维持培养；2）降低Zeocin剂量为原来的一半进行维持培养；3）使用正好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Zeocin剂量来维持培养【参考杀灭曲线】；

注意事项

1）本品具有一定的光敏感型，操作与培养过程尽量暗处进行。产品保存尽量避光。

2）本品有毒害，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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