产品产地： Molecular Research Center,Inc

产品商标： mrc

规格说明

TR118-50 TRI Reagent 最经典的一步法RNA抽提试剂，Molecular Research Center,Inc即TRIZOL的专利厂家

TR118-100 100 ml 1300

TR118-200 200 ml 2360

TR118-500 500 ml 5840

TRI REAGENT® - RNA / DNA / PROTEIN ISOLATION REAGENT

Cat. No. TR 118

储存：Store at 4 - 25 C

TRI Reagent产品描述

TRI Reagent®是一个完整的和现成的试剂总RNA或隔离的同时隔离的RNA、DNA和蛋白质样品的人类,动物,植物,酵母,细菌和病毒的起源。TRI Reagent是改进版本的受欢迎的单步总RNA的方法隔离(1、2)。这个高度可靠的技术执行与小和大量的组织或细胞培养,并允许同时处理大量样品。TRI Reagent和单步方法的国际专利。

TRI Reagent结合酚和硫氰酸胍mono-phase解决促进最直接和最有效的抑制核糖核酸酶的活动。生物样品均质或细胞溶解在TRI Reagent和匀浆由bromochloropropane分为水和有机相(猫。不。BP 151)或氯仿加法和离心。RNA仍然只在水相,相间的DNA和蛋白质的有机相。RNA从水相沉淀的异丙醇,用乙醇清洗,故。DNA和蛋白质都是按顺序从相间沉淀,乙醇和异丙醇的有机相,用乙醇清洗。

稳定性:TRI Reagent稳定在25 C至少两年从购买的日期(3)。

特殊处理措施:TRI Reagent含有毒药(酚)和一个刺激物(硫氰酸胍)。导致烧伤。可能是致命的。当使用TRI Reagent使用手套和眼睛保护(保护、安全护目镜)。不要遗留在皮肤或衣服。避免吸入蒸汽。请仔细阅读瓶子上的警告和化学物质。

如果接触：立即用大量的水冲洗眼睛或皮肤至少15分钟，立即寻求医护人员的帮助。

RNA的隔离

TRI Reagent的RNA隔离是最有效的方法。它隔离整个频谱RNA的RNA分子很少观察到孤立的其他方法。通常,基于列的方法可能人为地改变信使核糖核酸组成。整个过程可以完成1 h和未经碰撞的mrna结合30 - 150%大于与其他RNA隔离的方法。TRI Reagent隔离高质量RNA从多样的生物材料,包括动物和植物组织富含多糖和蛋白聚糖。孤立的RNA可以用于分析北部,点污点杂交,保利+选择、体外翻译、核糖核酸酶保护试验、分子克隆和rt - pcr。同时提取近100%的基因组DNA允许正常化每基因组DNA的基因表达研究的结果而不是更变量的总RNA或组织的重量。

协议

所需试剂,但不提供:氯仿或bromochloropropane、异丙醇、乙醇。

我们建议使用一次性聚丙烯管(猫。不。PP分子研究中心提供的141 - 144年),公司管从其他供应商应该确保完整性测试与TRI Reagent在离心12000 g。

该协议包括以下步骤:

1。均化作用:1毫升TRI Reagent+ 50 - 100毫克组织5 - 10 x 106细胞培养板或10平方厘米。

2。相分离:匀浆+ 0.1毫升BCP或0.2毫升氯仿。

3。核糖核酸沉淀:水相异丙醇+ 0.5毫升。

4。RNA洗:1毫升75%乙醇。

5。RNA溶解:FORMAzol®、0.5% SDS或水。

执行的操作程序是在室温下,除非声明。

1。均质化

答:组织。使均匀组织样本在TRI Reagent(1毫升/ 50 - 100毫克组织)使用glass-Teflon或Polytron均质器。样品数量不应该超过TRI Reagent的体积的10%用于均质化。

b细胞。细胞生长在单层应该直接在培养皿细胞溶解。倒了媒体,添加TRI Reagent和细胞溶解产物几次通过吸管。使用1毫升的三Reagnt每10平方厘米的培养皿。参见注意# 3在Notes中RNA隔离协议。应该首先沉淀悬浮细胞,然后在三细胞溶解试剂重复移液。使用1.0毫升的试剂5 - 10 x 106动物,植物或酵母细胞或每107个细菌细胞。

避免洗细胞前TRI Reagent的加入,因为这可能导致mRNA退化。一些酵母和细菌细胞可能需要中断一个均质器的使用。

2。相分离

在室温下储存匀浆5分钟允许完整的核蛋白质复合物解离。接下来,补充0.1毫升BCP的匀浆或0.2毫升氯仿/ 1毫升的TRI Reagent、样品紧密和动摇15秒。存储生成的混合物在室温下男童分钟,离心机在12000克15分钟4 c .离心后,混合物分离成一个较低的红色phenol-chloroform阶段,相间和无色上层水相。RNA仍然只在水相而DNA和蛋白质在界面和有机相。水相的体积约为60%体积的TRI Reagent用于均质化。

用BCP代替氯仿并不影响质量的孤立的RNA,DNA或蛋白质和其使用相分离试剂可能会减少污染的可能性RNA与DNA(4)。氯仿用于相分离不应含有异戊醇或其他添加剂。

重要的是要执行离心分离水和有机相在寒冷的(4到10 C)。如果在高温下进行的,剩余数量的DNA可能在水相隔离。在这种情况下,RNA可以用于分析北部,但它可能不是适合PCR。

3。核糖核酸沉淀

水相转移到新鲜的管并保存界面和有机相在随后的4 C DNA和蛋白质的分离。与异丙醇沉淀RNA从水相混合。使用0.5毫升的异丙醇/ 1毫升的TRI Reagent用于初始化。储存在室温下样品5 - 10分钟和离心机在12000 g 8分钟4 - 25 c . RNA沉淀离心之前(通常是看不见的)形成凝胶状或白色颗粒和底部的管。

当隔离RNA从富含多糖和蛋白聚糖来源,执行故障排除指南中描述的修改后的沉淀。

4。RNA洗

去掉上清洗RNA颗粒(涡流)和75%乙醇和随后在7500 g离心5分钟4 - 25 c添加至少1毫升的75%乙醇每毫升TRI Reagent用于初始化。

如果RNA颗粒积累的管,并倾向于浮动,泥沙颗粒在12000 g。

5。RNA增溶

去除乙醇洗并简要风干的RNA颗粒3 - 5分钟。重要的是不要完全干燥RNA颗粒,这样会大大降低其溶解度。不要干RNA由真空离心。干燥不溶解所需的RNA FORMAzol®(稳定甲酰胺,猫。不。佛121)。溶解在FORMAzol RNA,水或0.5% SDS通过几次的解决方案通过吸管的小费和孵化为10 - 15分钟则高达55 - c水或SDS溶液用于RNA溶解应该RNase-free由焦碳酸二乙酯(DEPC)治疗。RNA在使用前应该用乙醇沉淀从FORMAzol rt - pcr。

6。结果

TRI Reagent隔离整个频谱RNA的RNA分子很少观察到准备孤立的其他方法。溴化乙锭染色的RNA分离琼脂糖凝胶ormethylene蓝染色后的杂交膜RNA转移可视化两个主要的小(~ 2 kb)和大型(~ 5 kb)核糖体核糖核酸,低分子量(0.1 - -0.3 kb)RNA和离散的高分子量(7 - 15 kb)RNA。

最后制备DNA和蛋白质的总RNA基本上是免费的,比1.6 - 1.6 260/280。rt - pcr分析,DNase治疗可能是必要的优化结果。为了优化分光光度测量,RNA aliquots应与水或稀释缓冲pH > 7.5如磷酸盐缓冲剂(猫。不。SP 130)。蒸馏水与pH值< 7.0错误减少了260/280的比例,阻碍蛋白质的检测污染RNA样本(7)。

预期收益:

)组织(µg RNA /毫克组织):肝、脾、6 - 10µg;肾、3 - 4µg;骨骼肌、脑、1 - 1.5µg;胎盘,1 - 4µg;

B)培养细胞(µg RNA / 106细胞):上皮细胞,这个µg;成纤维细胞,5 - 7µg。

笔记

促进隔离的RNA小样本(< 106细胞或< 10毫克组织)进行均化(或细胞溶解)在0.8毫升的TRI Reagent补充2 - 8µl Polyacryl载体(猫。不。152年个人电脑)。接下来,添加BCP或氯仿和推进的相分离和其他措施隔离如上所述。

均质化后(前添加氯仿)样品可以存储至少一个月的-70 C。核糖核酸沉淀(步骤4,RNA洗)可以存储在75%乙醇在至少一个星期4 C或至少一年在-20 C。

对于生长在单层细胞,使用TRI Reagent的数量根据培养皿的面积,而不是手机号码。不足的TRI Reagent的使用可能导致污染的孤立的RNA与DNA。

手和尘埃可能是核糖核酸酶污染的主要来源。使用手套,保持管封闭的整个过程。

可能需要额外的隔离步骤为样本含量高的蛋白质,脂肪,多糖或细胞外物质如肌肉、脂肪组织和结节性的植物部分。均质化后,除去不溶性材料的匀浆在12000 g离心10分钟4 c .由此产生的颗粒包含细胞外膜,多糖和高分子量DNA而上层清液含有RNA。在脂肪组织样本,过多的脂肪收集作为顶层应删除。明显的上清转移到新的管并进行相分离和其他措施的RNA隔离如上所述。高分子量DNA可以从颗粒通过以下步骤2和3的DNA隔离协议。

参见RNA多聚腺苷酸+隔离和rt - pcr应用笔记和故障排除指南。

液体样品(羊水、血清、全血)应该使用TRI Reagent处理LS®(猫。不。TS 120)或TRI ReagentBD®(cat.no。126年结核病)。

二世。隔离TRI Reagent的DNA

相间的DNA是孤立和苯酚相分离从最初的匀浆中描述的RNA隔离协议。降水和一系列的洗后,DNA是故在8毫米氢氧化钠,中和和用于分析。三的DNA分离试剂可用于PCR,限制消化和南方的印迹。此外,组织和培养细胞的DNA全面复苏许可TRI Reagent的使用DNA含量的测定(2)分析样品。

协议

所需试剂,但不提供:乙醇、柠檬酸三钠和氢氧化钠。

该协议包括以下步骤:

1。DNA降水:苯酚阶段和相间+ 0.3毫升乙醇(1毫升TRI Reagent)。

2。DNA洗:1毫升0.1柠檬酸三钠的乙醇x 2 10%;2毫升75%乙醇。

3。DNA溶解:8毫米氢氧化钠。

这个过程在室温下进行,除非特殊。

协议描述了隔离苯酚阶段和相间的DNA样本的均质(或细胞溶解)1毫升的TRI Reagent。

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